基本原理: TRIZOL是一種新型總RNA抽提試劑,采用變性劑即內(nèi)含異硫氰酸胍、酚和β-疏基乙醇等變性物質(zhì),能迅速破碎細(xì)胞,抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。
各組分作用: 苯/酚: 主要作用是裂解細(xì)胞,使細(xì)胞中的蛋白和核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯/酚雖可有效地變性蛋白質(zhì),但不能抑制RNA酶活性。
異硫氰酸胍: 屬于解偶劑,是一類強力的蛋白質(zhì)變性劑,可溶解蛋白質(zhì),并使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)消失,細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解,核蛋白迅速與核酸分離,保護(hù)RNA完整性。
β-疏基乙醇: β-疏基乙醇主要破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。
8-羥基喹/啉: 0.1%的8-羥基喹/啉可以抑制RNase,與氯/仿聯(lián)合使用可以增強抑制作用。
檸檬酸鈉、EDTA: 可以絡(luò)合金屬離子,抑制金屬離子對核酸酶的輔助作用,且具有良好的緩沖能力。
甘油: 促進(jìn)苯/酚在溶液中的溶解,保證TRIZOL在4℃中保持單向存在。 PH: 低PH值的酚將使RNA進(jìn)入水相,這樣使其與仍留在有機相中的蛋白質(zhì)和DNA分離。
氯/仿: 其主要用處是用來分相,實際上是加速有機相和水相的分層,也有變性蛋白質(zhì)的作用。
異丙/醇: 沉淀核酸。增加RNA局部密度,使RNA從可溶狀態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)不可溶狀態(tài)。通過-OH的疏水作用使得RNA鏈中的親水基團受到保護(hù),等同于沉淀。
75%乙/醇: 無脫水作用,揮發(fā)性好從而減少水化層的形成,避免對下游實驗造成影響。通過有機溶劑相似相溶的原理達(dá)到洗滌RNA的目的。
RNA酶抑制劑: 異硫氰酸胍和β-巰基乙醇,再加上冰水浴,可以顯著降低RNA的降解速率。